El gen de resistencia a la roya del tallo del trigo Sr43 codifica una proteína quinasa inusual

Nature Genetics (2023)Citar este artículo

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Para salvaguardar el trigo harinero contra plagas y enfermedades, los mejoradores han introducido más de 200 genes de resistencia en su genoma, casi duplicando el número de genes de resistencia designados en el acervo genético del trigo1. El aislamiento de estos genes facilita su seguimiento rápido en los programas de mejoramiento y la incorporación en pilas de poligenes para una resistencia más duradera. Clonamos el gen de resistencia a la roya del tallo Sr43, que se cruzó con trigo harinero de la hierba silvestre Thinopyrum elongatum2,3. Sr43 codifica una proteína quinasa activa fusionada a dos dominios de función desconocida. El gen, que es exclusivo de Triticeae, parece haber surgido a través de un evento de fusión de genes hace entre 6,7 y 11,6 millones de años. La expresión transgénica de Sr43 en el trigo confirió altos niveles de resistencia a una amplia gama de aislamientos del patógeno que causa la roya del tallo, lo que destaca el valor potencial de Sr43 en el mejoramiento y la ingeniería de resistencia.

En todo el mundo, ~20% de la producción proyectada de trigo harinero (Triticum aestivum) se pierde cada año debido a plagas y enfermedades4. El despliegue de la variación genética para la resistencia a enfermedades es una forma sostenible y respetuosa con el medio ambiente de proteger los cultivos de trigo5. Durante más de 100 años, los mejoradores han realizado numerosos cruces para enriquecer el acervo genético del trigo con genes de resistencia. En particular, más de 200 de los 467 genes de resistencia actualmente designados en el trigo harinero cultivado tienen su origen fuera del acervo genético del trigo harinero1. Sin embargo, el despliegue de estos genes de resistencia interespecíficos a menudo se ve obstaculizado por el arrastre de enlace, es decir, la cointroducción de alelos nocivos de genes enlazados. Además, los genes de resistencia únicos tienden a ser superados rápidamente por la aparición de cepas de patógenos que rompen la resistencia6. La clonación de genes de resistencia individuales permitiría su introducción como pilas de poligenes modificados genéticamente, que probablemente proporcionen una resistencia más duradera7.

La mayoría de los ~291 genes de resistencia a enfermedades de las plantas clonados hasta la fecha codifican receptores intracelulares de la clase de repeticiones ricas en leucina y de unión a nucleótidos (NLR) o proteínas similares a receptores anclados en la membrana extracelular (RLP, llamados RLK cuando contienen una quinasa intracelular). ) (Cuadro complementario 1)1,8. Recientemente ha salido a la luz un nuevo grupo de genes de resistencia, cuyos miembros codifican dos proteínas quinasas fusionadas como una sola proteína. Estos genes de quinasa en tándem incluyen Rpg1, Yr15, Sr60, Sr62, Pm24, WTK4 y Rwt4 (refs. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Otros genes de resistencia ofrecen alguna variación a esta arquitectura con proteínas quinasas fusionadas con un dominio de transferencia de lípidos relacionado con proteínas reguladoras agudas esteroidogénicas (Yr36)16, un dominio C2 y una región multitransmembrana (Pm4)17, una proteína espermática principal (Snn3)18, un NLR (Tsn1, Rpg5 y Sm1)19,20,21 y un dominio tipo A del factor von Willebrand (Lr9)22.

Estos genes de resistencia que codifican la proteína de fusión de quinasa parecen ser exclusivos de Triticeae, el grupo de gramíneas que surgió hace 12 millones de años y abarca los cereales trigo, centeno (Secale cereale) y cebada (Hordeum vulgare)23. Sin embargo, los eventos de fusión que dieron origen a estos genes, lejos de ser raros y aislados, ocurrieron muchas veces entre diferentes clases de quinasas y generaron diversas combinaciones10,12. Esta innovación genómica resultó en resistencia contra patógenos fúngicos filogenéticamente distintos que abarcan la división ascomiceto/basidiomiceto de ~300 millones de años.

Aquí, clonamos el gen de resistencia a la roya del tallo Sr43, que se transfirió del pasto de trigo alto (Thinopyrum elongatum) al trigo harinero hace 45 años2,3. El gen de resistencia dominante Sr43 se introgresó en el cromosoma 7D del trigo hexaploide (Fig. 1a, b). Mutagenizamos granos de la línea de introgresión Sr43 con metanosulfonato de etilo (EMS) y analizamos 2244 familias M2 sobrevivientes para determinar la susceptibilidad a Puccinia graminis f. sp. tritici (Pgt). Identificamos 23 familias segregantes por susceptibilidad a la roya del tallo, de las cuales confirmamos diez mutantes independientes mediante pruebas de progenie (Tabla complementaria 2) y genotipificación (Figuras complementarias 1 a 11).

a, Th. elongatum cromosoma 7. b, Diagrama esquemático del cromosoma de translocación trigo-Thinopyrum. c, Mutaciones EMS identificadas a lo largo del modelo del gen Sr43 predicho. d, Diagrama esquemático de Sr43, que muestra los dominios predichos y los cambios de aminoácidos inducidos por las mutaciones de EMS. e, Modelo tridimensional de Sr43, según lo predicho por AlphaFold. verde, quinasa; naranja y azul, dominios DUF; enlazadores amarillos y flexibles. f, detalle estructural (cuadro discontinuo en e) de un sitio de unión de ATP de alta confianza (residuos rojos) en DUF668 unido a una molécula de ATP, según lo determinado por el programa de acoplamiento de moléculas pequeñas HADDOCK28. El ATP se representa como una estructura de barra (verde claro) conectada a los residuos DUF668 mediante enlaces de hidrógeno (líneas rojas).

Para clonar Sr43, realizamos una clasificación de flujo de cromosomas y secuenciamos el trigo-Th. elongatum recombinante cromosoma 7D en la línea parental y ocho mutantes (Datos extendidos Fig. 1 y Tablas complementarias 3 y 4). El ensamblaje de la secuencia de la línea parental y el mapeo de las lecturas mutantes identificaron una ventana de 10 kilobases (kb) en un andamio que contenía una mutación en los ocho mutantes. Para determinar la estructura del gen del candidato Sr43, (1) realizamos un análisis de secuenciación profunda del transcriptoma (RNA-seq) de hojas de plántulas de Sr43 y asignamos las lecturas al andamio genómico Sr43 (Datos extendidos Fig. 2a) y (2) secuenciamos Sr43 clones obtenidos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de una biblioteca de ADN complementario de longitud completa. Detectamos cuatro variantes de empalme diferentes (Datos extendidos Fig. 2b y Tablas complementarias 5 y 6). La variante de empalme 1 contenía las ocho mutaciones y constaba de 18 exones con un marco de lectura abierto previsto de 2598 pares de bases (pb) (Fig. 1c). Las ocho mutaciones fueron todas transiciones de G/C a A/T típicas de la mutagénesis EMS e introdujeron cambios no sinónimos (siete mutantes) o un codón de parada temprano en la secuencia de codificación predicha (Fig. 1c, d y Tablas complementarias 7 y 8) . La probabilidad de que todos los mutantes tuvieran una mutación en el mismo gen solo por casualidad de los 5822 genes no redundantes del cromosoma 7D (ref. 24) era de 4 × 10–6, lo que indica que el gen identificado es un buen candidato para Sr43 .

Como todas las mutaciones de EMS identificadas afectaron la transcripción Sr43 de longitud completa predominante (Fig. 1c), usamos su secuencia de 866 aminoácidos predicha para buscar dominios funcionales y homólogos. Determinamos que Sr43 alberga un dominio de quinasa N-terminal y dos dominios de función desconocida (DUF) en su extremo C (Fig. 1d). Cinco de las mutaciones residían dentro del dominio quinasa, y las tres mutaciones restantes afectaban a cualquiera de los DUF (Fig. 1d).

El homólogo de BLAST más cercano del dominio de la cinasa Sr43 fue la cinasa asociada al receptor de interleucina-1 de serina/treonina cinasa (STKc IRAK) (Fig. 12 complementaria), lo que indica que Sr43 es probablemente una cinasa. Otras búsquedas de homología sugirieron que el dominio de la quinasa está intacto (Fig. 13 complementaria). Apoyando esta observación, encontramos que una proteína de fusión Sr43 etiquetada por afinidad purificada de Eschericia coli fosforiló in vitro la girasa de ADN de la proteína de unión a maltosa (Figuras complementarias 14-16 y Tabla complementaria 9). Además, el mutante 1013a interrumpió uno de los residuos de glicina conservados en el bucle rico en glicina, lo que sugiere que se requiere actividad de quinasa para la función Sr43 (Tabla complementaria 10). El extremo C de Sr43, que contiene DUF3475 y DUF668, tiene una arquitectura de dominio similar (44 % de identidad) al extremo N de las proteínas SIMULADOR DE FITOSULFOQUINAS (PSI) de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), que son críticas para el crecimiento de las plantas25. A diferencia de Arabidopsis PSI1, Sr43 carecía de una señal de localización nuclear putativa o un sitio de miristoilación putativo. Sr43 no tenía dominio transmembrana, como predijo InterPro. Sin embargo, establecimos que Sr43 probablemente se localiza en el núcleo, el citoplasma y los plástidos, como lo demuestra la fluorescencia detectada a partir de la expresión transitoria de una construcción Sr43-GFP (proteína fluorescente verde) en células epidérmicas de hoja de Nicotiana benthamiana (Datos ampliados Fig. 3) . La localización nuclear y citoplasmática se confirmó en protoplastos de trigo transfectados con Sr43-GFP (Datos ampliados Fig. 3).

Por lo tanto, la estructura del dominio de Sr43 era claramente diferente de la de las proteínas codificadas por los ~ 290 genes de resistencia de plantas clonados, que eran en gran parte (73%) receptores inmunes extracelulares o intracelulares (Tabla complementaria 1). Para explorar la estructura inusual de Sr43 con más detalle, utilizamos el sistema aumentado con inteligencia artificial AlphaFold para generar un modelo tridimensional (3D)26 (Datos complementarios 1). Determinamos que Sr43 adopta una estructura modular, con la quinasa y los dos DUF separados por bucles de enlace flexibles (Fig. 1e). El dominio quinasa contenía hélices α y hebras β antiparalelas, mientras que las DUF eran completamente helicoidales. Comparamos la estructura predicha de la proteína Sr43 con la del Protein Data Bank27. Esto identificó similitudes estructurales entre DUF668 y algunas proteínas similares a proteínas quinasas similares a receptores fuera de sus dominios quinasas. Buscamos sitios de unión a ATP utilizando el programa de acoplamiento de moléculas pequeñas HADDOCK28 e identificamos un sitio de unión a ATP de alta confianza en DUF668 (Fig. 1f, Tabla complementaria 11 y Datos complementarios 2).

Clonamos un fragmento Sr43 genómico de 14 kb que incluye 3,2 kb de secuencia reguladora aguas arriba y 2,5 kb aguas abajo (Fig. 2a) (Tabla complementaria 12) e introdujimos la construcción binaria resultante en el cultivo de trigo Fielder. Obtuvimos una planta transgénica primaria (T0) y, sobre la base de PCR cuantitativa (qPCR), identificamos una línea genéticamente estable con un estimado de dos copias de Sr43 (Tablas complementarias 13–14 y Figura complementaria 17). Probamos líneas homocigotas T1 y T2 contra un panel geográfica y fenotípicamente diverso de 11 aislamientos de Pgt de América del Norte, Medio Oriente, Europa y África. En diez casos, las líneas de introgresión transgénica y de tipo salvaje Sr43 fueron resistentes, mientras que los cultivares Chinese Spring (el padre de introgresión) y Fielder fueron susceptibles (Fig. 2b, Datos extendidos, Fig. 4a, b y Tabla complementaria 15). Por el contrario, el aislado de Pgt 75ND717C fue intermediamente virulento en la introgresión Sr43 y las líneas transgénicas (Fig. 2b). Para el aislado de Pgt 69MN399, comparamos el fenotipo a 21 °C y 26 °C y notamos una marcada reducción en la resistencia mediada por Sr43 a la temperatura más alta, en línea con las observaciones previas29 (Fig. 2c). Tomados en conjunto, estos resultados confirman (1) la eficacia de amplio espectro de Sr43 (ref. 29), (2) que un fragmento genómico de Sr43 de 14 kb es suficiente para la función y (3) que la línea transgénica recapitula fielmente la raza específica y resistencia sensible a la temperatura de tipo salvaje Sr43.

a, Diagrama esquemático del fragmento genómico Sr43 utilizado para la transformación en trigo cv. jardinero. b, Hojas representativas de plántulas de Sr43 de tipo salvaje y líneas transgénicas junto con Fielder de tipo salvaje no transgénico y controles nulos inoculados con P. graminis f. sp. tritici aísla 14GEO189-1 (avirulento en Sr43) y 75ND717C (intermediamente virulento en Sr43). c, Efecto de la temperatura sobre la resistencia mediada por Sr43 al aislado de Pgt 69MN399. Barra de escala, 1 cm.

Buscamos homólogos de Sr43 para investigar su origen evolutivo. Identificamos proteínas que albergan el dominio quinasa o los dos DUF solos en la familia Poaceae que abarca 60 millones de años de evolución (Tablas complementarias 16 y 17 y Datos extendidos Figs. 5 y 6). Detectamos la disposición del dominio de la proteína Sr43 solo dentro de los géneros Thinopyrum, Triticum, Aegilops y Secale de la tribu Triticeae pero no dentro de Hordeum, lo que sugiere que Sr43 probablemente surgió hace entre 6,7 y 11,6 millones de años (Fig. 3 y Tabla complementaria 18). En aquellos linajes que carecían de un homólogo claro de Sr43, mapeamos los genes que codifican la quinasa y los DUF presentes en Sr43 en diferentes cromosomas (por ejemplo, Sorghum bicolor, Zea mays, T. urartu y Ae. sharonensis) o en el mismo cromosoma pero 6–36 megabases (Mb) aparte (Ae. tauschii y Setaria italica), lo que sugiere que el reclutamiento del dominio quinasa a los DUF en el locus Sr43 implicó un evento de recombinación ectópica (Tabla complementaria 18). En Thinopyrum elongatum, el estado ancestral y Sr43 se mantuvieron como un polimorfismo intraespecie; algunas especies de Aegilops y Triticum conservaron el estado ancestral (por ejemplo, Ae. tauschii), mientras que otras conservaron la innovación Sr43 (por ejemplo, los genomas T. aestivum y T. durum B) (Fig. 3).

La edad del último ancestro común en millones de años se indica en cada nodo sobre la base de la ref. 23. El clado Triticeae está resaltado en gris. Las especies se indican en la parte inferior y se abrevian como sigue: Tel, Thinopyrum elongatum; áspid, Ae. espeltoides; TtB, Triticum turgidum ssp. genoma de trigo duro B; TdB, genoma B de T. dicoccoides; TaB, genoma B de T. aestivum; TtA, T. turgidum ssp. genoma de trigo duro A; TdA, genoma de T. dicoccoides A; TaA, genoma de T. aestivum A; tu, T. nieve; O, Aegilops bicornis; Ase, Ae. Searsie; O, Ae. longísima; Fresno, Aegilops sharonensis; En, Ae. tauschii; TaD, genoma de T. aestivum D; Sc, escala de cereales; Hv, Hordeum vulgare; As, avena Sativa; Bd, desprendimiento de Brachypodium; Os, Oryza sativa; Sí, Setaria itálica; Sb, sorgo bicolor; Zm, maíz Zea. El número de genomas analizados para cada especie se indica entre paréntesis.

En resumen, clonamos el gen Sr43 de resistencia a la roya del tallo del trigo, que codifica una proteína quinasa fusionada con dos DUF. De los 82 genes de resistencia a Triticeae clonados hasta la fecha, la mayoría codifica NLR (n = 46), seguidos de proteínas de fusión de proteína quinasa (n = 15) (Tabla complementaria 19). De estas últimas, siete son quinasas en tándem, mientras que Sr43, Pm4, Snn3, Sm1, Tsn1, Yr36, Rpg5 y Lr9 son proteínas quinasas individuales o en tándem fusionadas a diferentes dominios16,17,18,19,20,21,22 (Datos extendidos Fig. 7 y Tabla Suplementaria 20). Se sabe poco sobre la función de las proteínas de fusión de cinasa, pero la mayoría confiere resistencia específica de raza que es fenotípicamente indistinguible de la resistencia mediada por NLR. Sus genes codificadores no entran en la categoría Lr34/Lr67 de resistencia a múltiples patógenos, adultos y de amplio espectro30,31. Para explicar el papel de estas quinasas en la resistencia, buscamos pistas de NLR cuyo modus operandi ahora se comprende bien. Los NLR pueden actuar como guardias que monitorean los componentes del huésped a los que apuntan los efectores de patógenos32. Estos protectores detectan la interacción entre un efector y su objetivo, lo que lleva a un cambio conformacional en el NLR que desencadena respuestas de defensa aguas abajo. Esta interacción tripartita crea un 'tira y afloja' evolutivo que impone una presión selectiva (1) sobre el efector para evadir la detección por parte del NLR mientras mantiene su capacidad para coaccionar al objetivo de patogenicidad, (2) sobre el NLR para reconocer nuevas variantes del efector y (3) en el objetivo de patogenicidad para evitar ser interrumpido por el efector mientras mantiene su función celular. La duplicación del objetivo de patogenicidad puede liberarlo de esta restricción funcional y proporcionar un 'señuelo' para el efector. Esta diversificación también puede resultar en que el señuelo se comporte genéticamente como el gen de resistencia33. En alrededor del 10 % de todos los NLR, el señuelo se ha integrado en el propio NLR34. Tal fusión de custodia-señuelo asegura que ambos componentes se hereden como una sola unidad operativa.

Por extrapolación, las proteínas de fusión de proteína quinasa pueden ser objetivos de patogenicidad protegidos por NLR. Todas las proteínas de fusión de proteína quinasa tienen una quinasa funcional aparente que se fusiona con un segundo dominio de quinasa, típicamente no funcional, pero a veces con un dominio completamente diferente, como en, por ejemplo, Sr43, Lr9 y Pm4 (datos extendidos Fig. 7). Tal vez como con los NLR que llevan un señuelo integrado, este segundo dominio podría ser un señuelo integrado, mientras que la quinasa funcional aparente ejerce la función de señalización. De hecho, las plantas producen varias enzimas, incluidas las proteínas quinasas con diferentes dominios integrados, para catalizar reacciones de varios sustratos. En el caso de las proteínas de resistencia a la proteína quinasa, el dominio integrado definiría los sustratos específicos de las proteínas Avr del patógeno, mientras que la quinasa catalizaría la fosforilación de la proteína Avr, el dominio integrado, en sí mismo o en un tercer socio de señalización para desencadenar la defensa corriente abajo. posiblemente a través de un protector NLR (datos extendidos Fig. 8a). La mutagénesis EMS de Yr15, Pm24, Sr62 y Sr43 ha mostrado una preponderancia de mutaciones de sentido erróneo que afectan el sitio activo de la quinasa o el bolsillo de unión a ATP del dominio de la quinasa funcional aparente (Datos extendidos, Fig. 7), lo que respalda la idea de que la señalización mediada por la quinasa es requerido para la función. Alternativamente, Sr43 (y por extrapolación de otras proteínas de resistencia a la fusión de quinasa) 35,36 puede funcionar sin un compañero de coseñalización de NLR (Datos extendidos Fig. 8b).

La expresión transgénica de Sr43 en un fondo diferente nos permitió confirmar la eficacia de amplio espectro de Sr43, destacando su valor potencial en la mejora de la resistencia. Sin embargo, es posible obtener mutantes de patógenos con ganancia de virulencia que han perdido la función AvrSr43 en condiciones de laboratorio37. Por lo tanto, Sr43 debe usarse en combinación con otros genes de resistencia de amplio espectro para maximizar su longevidad en el campo.

Mutagenizamos 2.700 semillas del trigo–Th. línea de introgresión elongatum RWG34 que contiene Sr43 (ref. 29). Las semillas secas se incubaron durante 16 h con 200 ml de una solución de EMS al 0,8 % (p/v) con agitación constante en un mezclador de rodillos (modelo SRT1, Stuart Scientific) para garantizar la máxima exposición homogénea de las semillas a EMS. Luego se eliminó el exceso de solución y las semillas se lavaron tres veces con 400 ml de agua del grifo. Las semillas M1 se cultivaron en el invernadero y se recolectaron las semillas de las familias M2 (cabezas individuales). Se fenotiparon ocho semillas por familia M2 con el aislado Pgt, raza TPMKC. Las semillas M3 derivadas de plantas M2 susceptibles también se ensayaron para confirmar que las plantas susceptibles M2 eran verdaderos mutantes no segregantes. Para descartar la contaminación de las semillas, se verificaron diez mutantes utilizando genotipado por secuenciación (GBS)38. Datos de GBS del fondo (primavera china), especies donantes (Th. elongatum, accesión PI531737 de USDA-ARS GRIN), primavera china–jueves. la línea de introgresión elongatum Sr43 (RWG34) y las líneas mutantes se asignaron a la secuencia del genoma de referencia de Chinese Spring39 utilizando BWA mem (v.0.7.12) con parámetros estándar40. Los resultados del mapeo se ordenaron y convirtieron al formato de compilación usando SAMtools41 (v.0.1.19). Los archivos de compilación se examinaron con un script personalizado publicado anteriormente vinculado a Zenodo42 para calcular el porcentaje de polimorfismos de un solo nucleótido del donante que se compartieron con la línea de introgresión por intervalo dado. Se probaron varias longitudes de intervalo; se observó una señal clara durante intervalos de 10 Mb.

Se prepararon suspensiones de cromosomas en metafase mitótica a partir de las puntas de las raíces de la línea de introgresión Sr43 y ocho mutantes EMS como se describe en la ref. 43 y ref. 44. Brevemente, las células del meristemo de la punta de la raíz se sincronizaron usando hidroxiurea, se acumularon en metafase usando amiprofos-metilo y se fijaron en formaldehído al 2 % (v/v) a 5 °C durante 20 min. Los cromosomas intactos se liberaron mediante homogeneización mecánica de 100 puntas de raíces en 600 µl de tampón LB01 enfriado con hielo45. Los microsatélites GAA se marcaron en cromosomas aislados mediante hibridación fluorescente in situ en suspensión (FISHIS) utilizando oligonucleótidos 5'-FITC-GAA7-FITC-3' (Sigma) según la ref. 46 y el ADN cromosómico se tiñó con 2 µg ml–1 de 4′,6-diamidino 2-fenilindol (DAPI). El análisis cromosómico y la clasificación se realizaron utilizando un citómetro de flujo y clasificador FACSAria II SORP (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Se adquirieron cariotipos de flujo bivariado que trazan la fluorescencia FITC y DAPI para cada muestra y los cromosomas se clasificaron a velocidades de 20 a 40 partículas por segundo. Dos lotes de 55.000 y 70.000 copias del cromosoma 7D con el Th. El segmento del cromosoma elongatum que lleva Sr43 se clasificó del Sr43-WT de tipo salvaje y se clasificó un lote de 14,000–66,000 copias de los ocho mutantes en tubos de PCR que contenían 40 μl de agua desionizada estéril (Tabla complementaria 3).

El contenido de cromosomas de las fracciones clasificadas por flujo se estimó mediante observaciones microscópicas de 1500–2000 cromosomas clasificados en una gota de 10 μl de tampón PRINS que contenía sacarosa al 2,5 % (p/v)47 en un portaobjetos de microscopio. Los cromosomas secados al aire se marcaron mediante FISH con sondas para la repetición pSc119.2, la repetición de la familia Afa y el ADN ribosómico 45S que permitió la identificación de todo el trigo y Th. cromosomas elongatum según la ref. 48. Para determinar el contenido cromosómico y la pureza en las fracciones clasificadas, al menos 100 cromosomas en cada muestra clasificada por flujo se clasificaron siguiendo el cariotipo descrito por la ref. 49.

Las dos muestras cromosómicas clasificadas por flujo por separado de los genotipos de tipo salvaje se usaron para la preparación de dos bibliotecas de secuenciación. Las muestras cromosómicas se trataron con proteinasa K (60 ng μl−1), después de lo cual se purificó el ADN sin amplificación. El flujo de muestras cromosómicas clasificadas de los mutantes se trató de manera similar, pero su contenido de ADN se amplificó a 2.5–12.6 μg mediante amplificación de desplazamiento múltiple (Tabla complementaria 3) utilizando un kit de amplificación de ADN Illustra GenomiPhi v.2 (GE Healthcare) como se describe en la ref. 50 y secuenciado por Novogene. Para los genotipos Sr43 de tipo salvaje, se fragmentaron 20 ng de ADN no amplificado en un volumen de 20 μl utilizando un Bioruptor Plus (Diagenode) cinco veces durante 30 s en el ajuste ALTO. Las bibliotecas para la secuenciación se prepararon a partir de ADN fragmentado utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina con las siguientes modificaciones: (1) la selección de tamaño se dirigió a un tamaño de biblioteca final más grande (~1000 pb) y (2) el enriquecimiento por PCR se realizó con seis ciclos de PCR. Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma HiSeq2500 utilizando un kit HiSeq Rapid SBS v.2 como lecturas de extremos emparejados de 250 pb. Los datos sin procesar se recortaron para obtener bases de baja calidad usando Trimmomatic51 y se ensamblaron en andamios con Meraculous52 (v.2.0.5) usando k-mers de 111 nucleótidos. Se eliminaron los andamios de menos de 1 kb. El montaje contenía 168.523 andamios con una longitud total de montaje de 1,29 gigabase (Gb). Entre ellos, 25.581 andamios tenían más de 13,9 kb con una longitud total de 631,8 Mb.

Se seleccionaron ocho mutantes susceptibles derivados de familias M2 independientes para el mapeo de MutChromSeq53. Las lecturas sin procesar de los ocho mutantes se asignaron individualmente a los fragmentos de andamiaje cortados de 10 kb utilizando BWA40 (v.0.7.12) y SAMtools41 (v.1.8). Se identificó que un fragmento tenía una mutación de un solo nucleótido en todos los mutantes. Calculamos la probabilidad de que este sea el gen candidato utilizando la fórmula número 4 desarrollada por la ref. 12, con 2598 pb de la secuencia codificante (CDS) de Sr43, asumiendo que el CDS promedio del gen tiene una longitud de 1000 pb y que el cromosoma 7D tiene 5822 genes. Todas las mutaciones identificadas fueron mutaciones de transición G a A o C a T, que son típicas de la mutagénesis EMS.

El ARN total se extrajo del chino Spring–Th. línea de introgresión elongatum Sr43 con un RNeasy Plant Mini Kit (n.º de catálogo/ID 74904, Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante y digerido con Dnase I (Roche). RNA-seq fue realizado por Novogene. Las lecturas de RNA-seq se recortaron con Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic). Se usó Hisat2 (v.2.1.0)54 para mapear las lecturas cortas en la secuencia genómica Sr43. El archivo de salida SAM se convirtió en un archivo BAM usando SAMtools41 (v.1.8) (http://www.htslib.org/) y se clasificó según su posición a lo largo de la secuencia genómica Sr43 y se indexó para su visualización por IGV (https:/ /software.broadinstitute.org/software/igv/). Para determinar el empalme alternativo de Sr43, construimos una biblioteca de ADNc de longitud completa utilizando un kit de síntesis de ADNc de PCR SMARTer (n.º de catálogo 634926, Clontech/TaKaRa). Las transcripciones correspondientes a cada una de las cuatro variantes de empalme se identificaron mediante la secuenciación de Sanger de 20 clones obtenidos de la transformación de PCR de largo alcance en la biblioteca de ADNc de longitud completa con cebadores específicos para los extremos 5 'y 3' de Sr43 (Tabla complementaria 5).

Sobre la base de la anotación del gen, se amplificaron por PCR tres segmentos superpuestos del gen Sr43 (Tabla complementaria 12) con ADN polimerasa Q5 (NEB) de alta fidelidad siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) y se acoplaron con la polimerasa de ADN Taq antes de clonarlos en el vector pCR2.1 (TOPO PCR Cloning Kits-K202020, Thermo Fisher Scientific). Los clones positivos se digirieron con tres conjuntos de enzimas de restricción, NotI, NotI-PvuI y PvuI-PmeI (NEB), para generar las partes 1, 2 y 3 del fragmento Sr43, respectivamente. Los fragmentos digeridos se purificaron en gel y luego las partes 2 y 3 se combinaron en una reacción de ligadura de tres vías con el vector binario pGGG-AH-NotI/PmeI12 digerido con NotI y PmeI, usando ADN ligasa T4 (M0202S, NEB). Posteriormente, la construcción binaria se linealizó con NotI y se introdujo la parte 1. Se verificó mediante secuenciación de Sanger un clon positivo con la parte 1 en la orientación correcta, pGGG-Sr43. El pGGG-Sr43 está disponible en Addgene con el número de acceso 186974.

La construcción binaria pGGG-Sr43 se transformó en trigo cv. Fielder utilizando la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens55. El número de copias de Sr43 se postuló analizando el número de copias del marcador seleccionable de higromicina B fosfotransferasa en plantas T0 y T1 por parte de iDNA Genetics usando qPCR56. De una familia T1 genéticamente estable que no se segrega, avanzamos una línea T2 (BW_30183) para realizar más pruebas de número de copias. Diseñamos cebadores específicos de genes para Sr43, el gen marcador seleccionable de higromicina B fosfotransferasa y genes de control endógeno de trigo de una sola copia, tres copias y seis copias (Tabla complementaria 13). Las secuencias de cebadores para los genes endógenos se diseñaron sobre la base del cv. Genoma de referencia de Fielder57. El ADN se extrajo de una sola planta T3 (derivada de la familia T2 BW_30183) utilizando el kit de extracción de ADN genómico de Qiagen (Qiagen, catálogo n.º 19060) con columnas de 500 por g (Qiagen, lote 169047970) siguiendo el Manual de ADN genómico de QIAGEN. La qPCR se realizó en una reacción de 10 μl con 1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad), cebador 0,5 μM y 2 ng μl−1 de ADN utilizando una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de una desnaturalización a 95 ° C durante 15 s y recocido + extensión a 60 °C durante 30 s, durante 40 ciclos en un sistema de PCR en tiempo real CFX96. El número de copias del gen Sr43 se calculó sobre la base de los genes de referencia endógenos (Figura 17 complementaria y Tabla 14 complementaria).

Los ensayos de roya del tallo se realizaron en invernadero o en cámaras de crecimiento. Las cámaras de crecimiento/invernadero se mantuvieron a 21 °C con un período de luz de 14 h y una humedad relativa de ~40 %. Las plantas se inocularon con P. graminis f. sp. tritici cuando la segunda hoja estaba completamente expandida, 10–12 días después de la siembra, a razón de ~0.12 mg de esporas por planta. Después de un período de incubación de 16 h en la oscuridad en condiciones de alta humedad (100%), las plántulas inoculadas se devolvieron al invernadero/cámara de crecimiento y luego se evaluaron para la reacción a la roya del tallo 12–14 días después. Los tipos de infección se registraron mediante la escala de Stakman58. Para las pruebas de sensibilidad a la temperatura, la temperatura alta se fijó en 26 °C. Las razas Pgt utilizadas en este estudio fueron TPMKC (aislado 74MN1409) de los Estados Unidos; QTHJC (aislamientos 75ND717C y 69MN399) de los Estados Unidos; TKTTF (aislado ET11a-18) de Etiopía; TTKTT (aislado KE184a/18) de Kenia; TKTSC (aislado IS nº 2079), TTTTF (aislado IS nº 2127) y TTTTC (aislado IS nº 2135) de Israel; TKTTF (aislado FR68-20) de Francia; TTRTF (aislado IT16a-18) de Italia; TKTTF (aislado UK-01) del Reino Unido; y TRTTF (aislado 14GEO189-1) de Georgia (Tabla complementaria 15).

Usamos InterPro v.88.0 para buscar dominios de familias de proteínas en Sr43, por ejemplo, un dominio transmembrana59. Para verificar la presencia de sitios de miristoilación y señales de localización nuclear, utilizamos Myristoylator60 y cNLS mapper61, respectivamente (consultado el 11 de marzo de 2023).

Utilizamos el código fuente abierto de AlphaFold v.2.0 (ref. 26) y la supercomputadora de la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah, Shaheen II (https://www.hpc.kaust.edu.sa/) a través del sistema multinodo Cabra montés (https://www.hpc.kaust.edu.sa/ibex). Ingresamos la secuencia de aminoácidos de Sr43 y la salida fue cinco modelos no relajados, cinco relajados y cinco clasificados en formato .pdb. Utilizamos el modeloranked_1.pdb que contiene las predicciones con la mayor confianza con la mejor puntuación de la prueba de diferencia de distancia local (lDDT) de 70,76. A continuación, ingresamos el modeloranked_1.pdb obtenido de Alphafold y cada dominio por separado en el servidor de comparación de estructuras de proteínas Dali27.

Utilizamos HADDOCK2.4, un servidor web para el cribado de sitios de unión de moléculas pequeñas28, para examinar el dominio DUF2 en busca de posibles sitios de unión de ATP. Los archivos de entrada consistían en el dominio DUF2 de Sr43 después de eliminar todos los bucles del archivo .pdb y ATP en formato .pdb. Los ajustes utilizados fueron:

Definir restricciones de interacción aleatoriamente ambiguas a partir de residuos accesibles: activado

Número de estructuras para acoplamiento de cuerpo rígido—10,000

Número de estructuras para refinamiento semiflexible: 400

Número de estructuras para el refinamiento final—400

Método de agrupación (RMSD o fracción de contactos comunes (FCC)): RMSD

Límite de RMSD para agrupamiento (recomendado: 7,5 A para RMSD, 0,60 para FCC)—2,0

Evdw 1—1.0

EElec 3—0.1

Temperatura inicial para el segundo paso de enfriamiento TAD con cadena lateral flexible en la interfaz: 500

Temperatura inicial para el tercer paso de enfriamiento TAD con interfaz completamente flexible—300

Número de pasos MD para TAD de alta temperatura de cuerpo rígido—0

Número de pasos MD durante la primera etapa de enfriamiento del cuerpo rígido: 0

Los archivos de salida fueron diez grupos de diferentes sitios de unión a ATP predichos. El conglomerado con la mejor puntuación de predicción (Z-score) fue el conglomerado 6.

El CDS nativo de Sr43 más dos nucleótidos adicionales (CC) al comienzo del CDS (para mantener el marco de lectura abierto con la etiqueta His6) se sintetizó comercialmente (Twist Bioscience) y se clonó en el vector de entrada Gateway pTwist_ENTR. Para la expresión de la proteína recombinante, se transfirió Sr43 al vector de expresión pDEST-His6-MBP mediante la reacción de la clonasa Gateway LR (Invitrogen). El clon resultante se verificó mediante secuenciación de Sanger.

La proteína marcada con His6-MBP-Sr43 se expresó en la cepa de E. coli Rosetta cultivando el cultivo bacteriano a una densidad óptica OD600 de 0,8 a 37 °C y luego induciendo la expresión de la proteína mediante la adición de isopropil β-d-tiogalactopiranósido 0,5 mM a 18 °C y más incubando el cultivo durante 14–16 h. La proteína recombinante se purificó en condiciones nativas utilizando perlas de agarosa Ni-NTA (n.º de catálogo Invitrogen R901-15) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La composición del tampón de la proteína His6-MBP-Sr43 purificada se cambió al tampón de reacción de la quinasa (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM y ATP 50 μM) usando columnas de desalinización PD10 (GE Cuidado de la salud). His6-MBP-Sr43 se mezcló con un sustrato comercial proteína de unión a maltosa ADN girasa (Prospec Protein Specialists PRO-616) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Después de agregar tampón de muestra SDS para detener la reacción, la proteína se desnaturalizó hirviéndola a 95 °C durante 10 min. Se utilizó electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para resolver las muestras de proteínas. El gel se tiñó con SimplyBlue SafeStain (Novex cat. no. LC6065) y se escindió la banda que correspondía a la proteína de interés, se cortó en trozos de 0,5 mm3 y se destiñeron con cuatro lavados secuenciales de 15 min cada uno con acetonitrilo y NH4HCO3 100 mM. . Las proteínas en las piezas de gel se redujeron con clorhidrato de Tris (2-carboxietil) fosfina 10 mM (TCEP, C-4706 Sigma) en NH4HCO3 100 mM a 37 °C durante 1 hora. Luego, los enlaces disulfuro reducidos se alquilaron con yodoacetamida 50 mM a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la reducción y alquilación de las proteínas, se digirieron con tripsina (tripsina porcina, Promega) a 37 °C durante la noche. Se añadió ácido fórmico a una concentración final del 1% para detener la digestión y los péptidos trípticos se recuperaron incubando las piezas de gel en acetonitrilo. Los péptidos recuperados se desalinizaron con un cartucho de vacío Sep-Pak C18 de 1 ml (SKU de Waters: WAT023590) y se analizaron mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (Fig. 14 complementaria). Las muestras de péptidos se separaron utilizando una columna C18 conectada a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos (Acclaim PepMap C18, 25 cm de longitud, 75 m de DI, 3 m de tamaño de partícula, porosidad 100, Dionex). El gradiente de LC aumentó del 5 % de disolvente B (agua/ACN/ácido fórmico, 20/80/0,1, v/v/v) al 45 % de disolvente B durante 45 min y luego al 90 % de disolvente B durante 10 min. Utilizando la fragmentación HCD en el instrumento Orbitrap Fusion Lumos, el instrumento MS registró espectros de fragmentación en los diez péptidos principales. Utilizando la interfaz msConvert, los archivos de datos RAW se convirtieron en archivos MGF. Se usó el servidor Mascot para realizar búsquedas en la base de datos y se usaron los siguientes criterios: (1) base de datos que contenía las secuencias de aminoácidos de Sr43, MBP y proteínas contaminantes; (2) especificidad enzimática (tripsina que permite dos escisiones perdidas permitidas); (3) los residuos de cisteína están modificados de forma fija (carbamidometilo); (4) la fosforilación de los residuos S, T e Y puede modificarse de forma variable; (5) las masas precursoras son tolerables a 5 ppm; (5) los iones de fragmento son tolerables a 0,02 Da. Se utilizaron puntuaciones de Mascot y MD para filtrar los resultados. Los péptidos identificados para determinar la cobertura proteica de la proteína de unión a maltosa se muestran cuando se incuban solos y cuando se incuban con His6-MBP-Sr43 (Figuras complementarias 15 y 16).

Para generar la construcción 35S:Sr43-GFP, se sintetizó un marco de lectura abierto optimizado por codón de la versión 1 de empalme de Sr43 y se ligó en pDONR221 (Twist Bioscience). A continuación, el clon de entrada se introdujo en el vector binario pB7FGW2,0 mediante una única reacción Gateway LR (Invitrogen). La construcción 35S:PLSP2A-mRFP se generó mediante la combinación de un clon de entrada de PLSP2A CDS con el promotor p35S y el indicador fluorescente mRFP mediante la clonación secuencial de Gateway.

Las construcciones 35S:Sr43-GFP y 35S:PLSP2A-mRFP se transfirieron a la cepa GV3101 de A. tumefaciens y se infiltraron en hojas de tabaco como se describe en la ref. 62. La señal de GFP se excitó a 488 nm y se detectó entre 500 y 535 nm. La señal mRFP se excitó a 555 nm y se detectó entre 566 y 646 nm. Las imágenes se adquirieron utilizando un Leica SP8 Stellaris FALCON invertido con un objetivo HC PL APO 63× 1,2 W CORR UVIS CS2.

Para generar la construcción pZmUbi:GFP-Sr43, se subclonó el CDS Sr43 de la versión 1 de empalme del pDONR221 mencionado anteriormente en el vector pJET1.2 (Thermo Fisher) como un módulo de nivel I para una posterior clonación Golden Gate63. La construcción de expresión de nivel II se ensambló con el esqueleto de nivel II (BB10), el promotor de ZmUbiquitin de nivel I, la etiqueta GFP de nivel I, el Sr43 de nivel I y el terminador NOS de nivel I a través de una reacción de ligadura de corte BsaI63. La construcción pZmUbi:NLS-mCherry se generó de la misma manera combinando el esqueleto de nivel II, el promotor ZmUbqiuitin de nivel I, la secuencia de localización nuclear de nivel I, el mCherry de nivel I y el terminador NOS de nivel I. El control de pZmUbi:GFP se generó transfiriendo el CDS de GFP a través de la reacción de clonasa LR a pZmUbi:GW64.

Los ADN de plásmido se purificaron de E. coli que albergaba pZmUbi:GFP-Sr43, pZmUbi:NLS-mCherry, pZmUbi:GFP con el kit NucleoBond Xtra Maxi Plus (Macherey-Nagel). Se aislaron células mesófilas de plántulas de trigo de 9 días de edad (cv. Fielder) cultivadas en condiciones de día corto (8 h de luz, 16 h de oscuridad). El aislamiento y la transfección de protoplastos se realizaron como se describe en la ref. 64.

La fluorescencia se observó con un microscopio confocal Carl Zeiss LSM vertical 880 Axio Imager 2 con un objetivo Plan-Apochromat 63x/1,4 Oil DIC M27. GFP se excitó usando un láser de argón (488 nm) y se detectó entre 494 y 552 nm. El mCherry se excitó usando un láser de estado sólido bombeado por diodos (561 nm) y se detectó fluorescencia entre 596 y 649 nm.

Construimos un árbol filogenético sobre la base de las secuencias de proteínas alineadas de 100 mejores aciertos (ID ≥75%) de la secuencia del dominio de la quinasa y la secuencia de la región Sr43 DUF contra la base de datos de proteínas NCBI. El árbol filogenético (método de unión de vecinos) para los dominios quinasa y DUF se calculó con Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) y se dibujó con iTOL (https://itol. embl.de/).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados en el estudio actual están disponibles públicamente de la siguiente manera. Las lecturas de secuencia se depositaron en el Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de proyecto PRJEB52878 (datos GBS), PRJEB51958 (datos ordenados por flujo cromosómico) y PRJEB52088 (datos RNA-seq). El gen Sr43 y la secuencia de transcripción se depositaron en NCBI Genbank con el número de acceso ON237711. El ensamblaje del cromosoma Sr43 se ha depositado en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6777941). En el estudio se utilizaron las siguientes bases de datos/conjuntos de datos públicos: Chinese Spring reference genoma39, Gramene (http://www.gramene.org/), https://ensembl.gramene.org/Multi/Tools/Blast, https:/ /wheat.pw.usda.gov/GG3/blast, secuencia de proteína no redundante BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome), navegador de taxonomía ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=1437183), AlphaFold26 (https://alphafold.ebi.ac.uk), Dali27 (http://ekhidna2. biocenter.helsinki.fi/dali/) y HADDOCK28 (https://www.bonvinlab.org/education/HADDOCK-binding-sites/.

Los scripts utilizados en estos análisis han sido publicados en GitHub (https://github.com/steuernb/GBS_introgression_line_analysis) y vinculados con Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/394326594)42.

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Agradecemos a Y. Wang por su ayuda con el fenotipado y la compilación de la Tabla complementaria 19; ES Vande Loo para preparación de medios; H. Zhang y AW Weatherhead por su ayuda con la espectrometría de masas (todos KAUST, Arabia Saudita); Y. Jin (USDA-ARS, Minnesota, EE. UU.) para el uso de los aislados de Pgt 74MN1409, 75ND717C, 69MN399 y 14GEO189-1; M. van Slageren (Kew, Reino Unido) por su ayuda con la nomenclatura de especies; S. Saile y L. Rohr (Universidad de Tübingen, Alemania) para los módulos pZmUbi y NLS Golden Gate; Z. Dubská, R. Šperková y J. Weiserová para la preparación de muestras de cromosomas para citometría de flujo; y M. Said y P. Cápál para la clasificación cromosómica (todos IEB, República Checa). Esta investigación fue apoyada por el grupo de Computación de Investigación de NBI y la Plataforma de Informática en el Centro John Innes, Reino Unido, y financiada con fondos de la Fundación 2Blades, EE. UU., a BJS y BBHW; el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) Designing Future Wheat Cross-Institute Strategic Program to BBHW (BBS/E/J/000PR9780); Premio de beca Marie Curie Fellowship 'AEGILWHEAT' (H2020-MSCA-IF-2016-746253) y la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación de Hungría (K135057) a IM; proyecto FEDER 'Las plantas como herramienta para el desarrollo global sostenible' (nº CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827) a JB, KH, MK y JD; Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a BBHW, Ł.J., IB y HH; la Fundación Lieberman-Okinow de la Universidad de Minnesota para BJS; la Fundación Daimler y Benz, por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) CEPLAS (EXC 2048/1—Project-ID: 390686111) y el Programa DFG Emmy Noether (SA 4093/1-1) a IMLS; la Fundación Gordon y Betty Moore a través de la subvención GBMF4725 a la Fundación 2Blades y JDGJ; y la Fundación Benéfica Gatsby a JDGJ

T. Lynne Reuber

Dirección actual: Enko Chem, Mystic, CT, EE. UU.

István Molnár

Dirección actual: Centro de Investigación Agrícola, ELKH, Instituto Agrícola, Martonvásár, Hungría

Programa de Ciencias de las Plantas, División de Ingeniería y Ciencias Biológicas y Ambientales (BESE), Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah (KAUST), Thuwal, Arabia Saudita

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou y Brande BH Wulff

Centro de Agricultura del Desierto, KAUST, Thuwal, Arabia Saudita

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou y Brande BH Wulff

Centro John Innes, Parque de Investigación de Norwich, Norwich, Reino Unido

Guotai Yu, Catherine Gardener, Yajuan Yue, Ngonidzashe Kangara, Burkhard Steuernagel, Sadiye Hayta, Mark Smedley, Wendy Harwood y Brande BH Wulff

Departamento de Fitopatología, Universidad de Minnesota, St. Paul, MN, EE. UU.

Oadi Matny, Ryan Johnson, Matthew N. Rouse y Brian J. Steffenson

Programa de Biociencia, Iniciativa de Salud Inteligente, BESE, KAUST, Thuwal, Arabia Saudita

Spyridon Gourdoupis y Lukasz Jaremko

Departamento de Bioquímica Vegetal, Centro de Biología Molecular Vegetal (ZMBP), Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Yan L. Wang y Thorsten Nürnberger

Instituto de Ciencias de las Plantas, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

Emma E. Crean e Isabel M.-L. saurio

Clúster de Excelencia en Ciencias Vegetales (CEPLAS), Colonia, Alemania

Isabel M.-L. saurio

Departamento de Agroecología, Universidad de Aarhus, Slagelse, Dinamarca

Mehran Patpour

Departamento de Patología Vegetal, Universidad Estatal de Kansas, Manhattan, KS, EE. UU.

Shuangye Wu y Jesse Polonia

Laboratorio Sainsbury, Universidad de East Anglia, Norwich, Reino Unido

Jonathan D.G. Jones

Fundación 2Blades, Evanston, IL, EE. UU.

T. Lynne Reuber

Instituto de Investigación de Cultivos de Cereales, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Moshé Ronen

Instituto de Investigación de Cultivos de Cereales y la Escuela de Ciencias Vegetales y Seguridad Alimentaria, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Amir Sharon

USDA-ARS, Laboratorio de Enfermedades de los Cereales, St. Paul, MN, EE. UU.

matthew n. rouse

Unidad de Investigación Genética y Mejoramiento de Cultivos, USDA-ARS, Centro de Investigación Regional Occidental, Albany, CA, EE. UU.

steven xu

Centro de la Región Haná para la Investigación Biotecnológica y Agrícola, Instituto de Botánica Experimental de la Academia Checa de Ciencias, Olomouc, República Checa

Kateřina Holušová, Jan Bartoš, István Molnár, Miroslava Karafiátová y Jaroslav Doležel

Centro de Investigación del Mar Rojo, BESE, KAUST, Thuwal, Arabia Saudita

lukasz jaremko

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GY generó la población mutante. Mutantes seleccionados y verificados por RJ, BJS y NK. Mutantes genotipados BS, SW y JP. IM, MK y JD realizaron la clasificación y amplificación del flujo cromosómico. GY, KH y JB hicieron el ensamblaje de los cromosomas. GY realizó análisis bioinformáticos para identificar Sr43. GY extrajo el ARN y determinó la estructura del gen Sr43 y el empalme alternativo. GY, SG y Ł.J. Sr43 anotado. SG y Ł.J. realizó análisis de modelado 3D. MS desarrolló el vector binario. GY diseñó la construcción Sr43. SH y WH transformaron Sr43 en trigo. GY, OM, MP y MNR fenotiparon las líneas transgénicas. FRA e IB (en N. benthamiana) y YLW, EEC, TN e IM-LS (en trigo) determinaron la localización de Sr43. NR y HH realizaron un ensayo de quinasa. GY realizó filogenética y synteny. OM, SX, MNR, MR, AS, JDGJ, CG, YY y TLR proporcionaron germoplasma, cultivos de roya o apoyo y asesoramiento científico. BBHW, GY y BJS concibieron el estudio. GY y BBHW redactó el manuscrito. Todos los coautores leyeron y aprobaron el manuscrito final. Los autores se agrupan por institución en la lista de autores, excepto los primeros seis y los últimos seis autores.

Correspondencia a Brian J. Steffenson o Brande BH Wulff.

GY y BBHW son inventores de la solicitud de patente provisional de EE. UU. 63/250,413 presentada por 2Blades y relacionada con el uso de Sr43 para la resistencia a la roya del tallo en trigo transgénico. TLR fue empleado por la Fundación 2Blades, que cofinanció el trabajo. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Genetics agradece a Tzion Fahima, Zhiyong Liu y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El diagrama de puntos de DAPI (eje x) frente a FITC (eje y) se obtuvo después del análisis de suspensiones cromosómicas teñidas con DAPI marcadas por FISHIS con sondas conjugadas con FITC para microsatélites GAA y ACG. Los cromosomas de translocación 7D/7el2 se clasificaron desde la ventana de clasificación que se muestra como un rectángulo rojo con purezas del 60 al 65 %. Recuadro: cromosoma de translocación 7D/7el2 después de FISH con sondas para repetición pSc119.2 (verde), repetición de la familia Afa (rojo) y ADNr 45S (amarillo) que se usó para identificar cromosomas en la fracción clasificada. Los cromosomas se contrastaron con DAPI (azul).

a, Mapeo de lecturas de RNA-seq del transcriptoma de la hoja en el locus Sr43. b, variantes de corte y empalme de ARNm identificadas mediante la secuenciación de clones de ADNc de longitud completa. Los intrones y los exones están representados por líneas y recuadros, respectivamente. Las variantes de empalme 1, 2, 3 y 4 tienen 8, 7, 5 y 6 mutaciones inducidas por EMS en la secuencia codificante, respectivamente.

a, Expresión transitoria mediada por Agrobacterium de una construcción de fusión Sr43-GFP o una construcción de GFP impulsada por el promotor 35 S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en Nicotiana benthamiana. La fluorescencia de GFP en células epidérmicas se registró 3 días después de la infiltración mediante microscopía de barrido láser confocal. b, Expresión transitoria mediada por Agrobacterium de 35 S:Sr43-GFP con una construcción marcadora de plastidio 35 S:PLSP2A-RFP en N. benthamiana. La fluorescencia de GFP o RFP en células epidérmicas se registró 3 días después de la infiltración mediante microscopía de barrido láser confocal. c, expresión transitoria de una construcción de fusión ZmUbi:GFP-Sr43 con marcador nuclear ZmUbi:NLS-mCherry en células de mesófilo de trigo (panel superior) y un ZmUbi:GFP como control (panel inferior). La fluorescencia de GFP y mCherry se registró de 16 a 20 horas después de la transfección mediante microscopía de escaneo láser confocal. Una celda no transformada se indica con una flecha negra. La barra de escala en todas las imágenes es de 20 µm. Los núcleos (N), el citoplasma (C) y los plástidos (P) se indican en las imágenes con flechas blancas. Los tamaños de las proteínas de fusión GFP y Sr43-GFP se estiman en 27 y 126 kDa, respectivamente. Los experimentos se repitieron en cinco (Sr43-GFP, panel a), dos (GFP, panel b), tres (panel b), cinco (GFP-Sr43) y dos (GFP) experimentos independientes, respectivamente, con resultados similares. En los experimentos con N. benthamiana, infiltramos dos hojas y analizamos más de 100 núcleos por hoja.

a, líneas transgénicas homocigóticas de la generación T1 junto con el cultivar padre no transgénico Fielder. b, Líneas transgénicas homocigóticas y segregantes nulos de la generación T2. Barra de escala, 1 cm.

Se aplicó un umbral mínimo de cobertura del 94% y una identidad ≥60%. ATSS, Aegilops tauschii subesp. estrangulado HVSV, Hordeum vulgare subesp. vulgar; LR, Lolium rígido; SO, arroz sativa; PV, Panicum virgatum; SI, italiano Setaria; TA, Trigo de verano; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. duro ZM, Zea Mays.

Se aplicó un umbral mínimo de ≥99% de cobertura y una identidad de ≥70%. ATSS, Aegilops tauschii subesp. estrangulado BD, Brachypodium distachyon; DE, Exilio Digitaria; CE, Eragrostus curvula; HV, Bardeum vulgare; HVSV, Hordeum vulgare subesp. vulgar; LR, Lolium rígido; ML, Miscanthus lutarioriparius; OB, Oryza brachyantha; OMVG, Oryza meyeriana var. granulado SO, arroz sativa; OSIG, Grupo de Arroz de la India; OSJG, Grupo Rice Sativa Japonica; PH, Panicum hallii; PHVH, Panicum hallii var. del salón; PM, Panicum miliaceum; PV, Panicum virgatum; SI, italiano Setaria; SV, Setaria verdi; SB, sorgo bicolor; TA, Trigo de verano; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. duro Tú, el trigo en el calor; ZM, Zea mays; ZP, malas hierbas de los pantanos.

Los sitios activos y de unión a ATP de las quinasas se indican mediante recuadros y círculos en las quinasas activas y pseudoquinasas, respectivamente, según lo determinado por exploración Interpro, búsqueda de homología en modelos 3D derivados de AlphaFold y/o BLAST. Las barras blancas indican mutaciones sin sentido de pérdida de función obtenidas de las pantallas de mutantes EMS. No se muestran ocho mutaciones en los dominios enlazadores. Las proteínas están organizadas de arriba a abajo por fecha de publicación: Rpg1, Yr36, Tsn1, Rpg5, Yr15, Sr60, Pm24, Sm1, Snn3, Pm4 (codificadas por empalme versión 2), WTK4, Rwt4, Sr62 (refs. 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21), Sr43 (este estudio) y Lr9 (ref. 22). START, transferencia de lípidos relacionados con proteínas reguladoras agudas esteroidogénicas; NLR, unión de nucleótidos y repetición rica en leucina; MSP, proteína mayoritaria de esperma; C2, dominio C2; PRT C, dominio C-terminal de fosforribosil transferasa; DUF, dominio de función desconocida; vWA, dominio tipo A del factor von Willebrand. Las barras blancas indican la posición de las mutaciones de pérdida de función derivadas de EMS (excluyendo las mutaciones tempranas del codón de parada) donde están disponibles. El número 9 debajo del sitio activo en la quinasa activa de Lr9 indica la presencia de nueve mutaciones.

La proteína de fusión de proteína quinasa (PK) contiene un señuelo integrado (ID) que atrapa la proteína efectora de avirulencia (cuadrado rojo). Esto desencadena una autofosforilación de la proteína quinasa o señuelo, el efector o el protector de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos. Esto da como resultado un cambio conformacional que a su vez desencadena una cascada de señales que conduce a respuestas de defensa e inmunidad aguas abajo.

Figs suplementarias. 1–17.

Tablas complementarias 1–20

Modelo tridimensional de Sr43, según lo predicho por AlphaFold.

Modelo tridimensional de Sr43 con ATP, según lo predicho por AlphaFold.

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Reimpresiones y permisos

Yu, G., Matny, O., Gourdoupis, S. et al. El gen de resistencia a la roya del tallo del trigo Sr43 codifica una proteína quinasa inusual. Nat Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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Recibido: 03 julio 2022

Aceptado: 18 abril 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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Genética de la naturaleza (2023)